Descubrimiento e ingeniería racional de PET hidrolasa con propiedades de PET hidrolasa tanto mesófilas como termófilas.

Jul 09, 2023

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4556 (2023) Citar este artículo

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El exceso de desechos de tereftalato de polietileno (PET) causa una variedad de problemas. Se ha llevado a cabo una extensa investigación centrada en el desarrollo de PET hidrolasas superiores para el bioreciclaje de PET. Sin embargo, las enzimas plantilla empleadas en ingeniería enzimática se centraron principalmente en IsPETase y cutinasa de compost de ramas de hojas, que exhiben propiedades hidrolíticas mesófilas y termófilas, respectivamente. En este documento, informamos sobre una PET hidrolasa de Cryptosporangium aurantiacum (CaPETase) que exhibe una alta termoestabilidad y una notable actividad de degradación de PET a temperatura ambiente. Descubrimos la estructura cristalina de CaPETasa, que muestra una conformación de columna vertebral distinta en el sitio activo y residuos que forman la hendidura de unión del sustrato, en comparación con otras hidrolasas de PET. Además, desarrollamos una variante de CaPETaseM9 que exhibe una termoestabilidad robusta con una Tm de 83,2 °C y una actividad hidrolítica de PET 41,7 veces mayor a 60 °C en comparación con CaPETaseWT. CaPETaseM9 descompone casi por completo el polvo de PET posconsumo, tanto transparente como coloreado, a 55 °C en medio día en un biorreactor con pH estable.

Los plásticos son polímeros sintéticos, con ventajas de resistencia química, peso ligero y bajo costo. Se han utilizado ampliamente en todo el mundo desde la década de 1950 y se han vuelto esenciales en nuestra vida diaria1,2. Sin embargo, debido a que los plásticos no se descomponen naturalmente, miles de millones de toneladas de desechos plásticos en vertederos, flotando en islas de desechos en el océano y dispersos como microplásticos han provocado una grave contaminación global3,4,5,6,7. Los gobiernos y los fabricantes de plástico de todo el mundo son conscientes de estos problemas, y en los últimos años se ha acelerado la investigación y el desarrollo centrados en estrategias de reciclaje químico y biológico de residuos plásticos8,9,10.

El tereftalato de polietileno (PET), un poliéster compuesto de unidades de ácido tereftálico (TPA) y etilenglicol, es un material de embalaje plástico muy utilizado y relativamente fácil de reciclar. En las últimas dos décadas se han realizado activamente estudios sobre la degradación biológica del PET8,11,12,13. La tecnología de bioreciclaje de PET incluye la hidrólisis del PET por microorganismos o enzimas y su conversión en productos químicos de alto valor agregado, lo que en última instancia establece una economía circular para el PET11,14,15,16.

Hasta la fecha se han descubierto y caracterizado bioquímica y estructuralmente diversas enzimas capaces de hidrolizar el PET. En particular, la PETasa de Ideonella sakaiensis 201-F6 (IsPETase) exhibe la mayor actividad hidrolítica del PET a temperatura ambiente y se considera una enzima prometedora para el tratamiento de residuos de PET17. En consecuencia, actualmente se están llevando a cabo varios estudios de ingeniería enzimática para mejorar la eficiencia de la hidrólisis del PET y la estabilidad térmica de IsPETase, y se han informado variantes con un rendimiento mejorado18,19,20,21,22,23,24. Recientemente, se ha descubierto la cutinasa del compost de ramas de hojas (LCC) derivada del metagenoma, que exhibe propiedades termófilas25. Su variante ha demostrado exhibir una alta actividad de despolimerización de PET en un sistema de biorreactor a 72 °C, lo que lo convierte en un candidato para el reciclaje biológico de PET26. Además, se están realizando esfuerzos para descubrir nuevas enzimas que degradan el PET, y enzimas de diversos microorganismos y metagenomas ambientales, como las cutinasas de Thermobifida fusca (TfCut1,2)27, las cutinasas de Thermomonospora curvata DSM43183 (Tcur1278,0390)28, la Bacterium HR29 (BhrPETase) )29, se han reportado Fusarium solani pisi (FsCut)30, Humicola insolens (HiC)31,32, PET233, PET533, PET633 y PHL734. Y recientemente, se descubrieron PET hidrolasas termotolerantes mediante minería del genoma en bioinformática35.

Para una aplicación viable de la hidrólisis enzimática del PET, la actividad catalítica inherentemente alta de las PET hidrolasas es un factor crucial como punto de partida. Además, explotar las propiedades termofílicas de la PET hidrolasa también es una estrategia eficiente para el desarrollo de PET hidrolasas superiores, porque la operación a alta temperatura cerca de la temperatura de transición vítrea del material PET es favorable para el rendimiento de degradación del PET36. Por lo tanto, es muy necesario el descubrimiento de enzimas prometedoras que degraden el PET que tengan una alta actividad catalítica y propiedades de termoestabilidad altas para proporcionar información sobre la reacción de catálisis y ampliar el alcance de los biocatalizadores de PET eficientes.

Hay un rápido progreso en la investigación sobre el desarrollo de enzimas eficientes que degradan el PET y han surgido numerosas variantes. No obstante, las PET hidrolasas desarrolladas recientemente no superan a las enzimas informadas anteriormente en términos de catálisis enzimática y termoestabilidad. Por lo tanto, las enzimas plantilla utilizadas para la ingeniería enzimática se centran principalmente en IsPETasa y LCC, que tienen propiedades hidrolíticas mesófilas y termófilas, respectivamente. En el presente estudio, informamos una PET hidrolasa de Cryptosporangium aurantiacum (CaPETase) que exhibe una notable actividad de degradación de PET a temperatura ambiente y una alta termoestabilidad. La estructura cristalina de CaPETase indica que la enzima tiene un sitio activo único en comparación con otras PET hidrolasas conocidas. A través de la ingeniería de proteínas racional guiada por la estructura, desarrollamos una variante robusta de CaPETasa que exhibe una actividad enzimática y una termoestabilidad notablemente mejoradas. La aplicabilidad de esta variante en la industria del reciclaje se demostró aún más al evaluar su actividad con un biorreactor con pH estadístico.

Para descubrir una PET hidrolasa, realizamos un análisis de homología de secuencia utilizando la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y seleccionamos 10 candidatos a PETasa (ver "Métodos" para más detalles). Se construyó un árbol filogenético para los 10 candidatos a PETasa seleccionados y las 17 PET hidrolasas informadas. Las 27 enzimas se dividieron en dos grupos: un grupo contenía enzimas mesófilas, como IsPETase, y el otro grupo contenía enzimas termófilas, como TfCut2 y LCC (Fig. 1a, Fig. 1 complementaria y Tabla complementaria 1). El árbol filogenético se separó en 10 subgrupos, y 3 candidatos de PETasa seleccionados, a saber, RZL00883.1, KOX11336.1 y SHM40309.1, formaron linajes discretos con bajas relaciones filogenéticas con las PET hidrolasas informadas (Fig. 1a). Para caracterizar los 10 candidatos a PETasa (PC) seleccionados, primero intentamos producirlos en una forma truncada con péptido señal. Ocho de los 10 candidatos a PETasa se produjeron con éxito, excepto KOX11336.1 y MAM88718.1. También medimos la temperatura de fusión (Tm) de los ocho candidatos a PETasa para determinar la termoestabilidad de estas enzimas. Los candidatos exhibieron un rango de valores de Tm de 38,6 °C a 70,5 °C (Fig. 1b y Fig. complementaria 2). Luego verificamos la actividad hidrolítica del PET de los ocho candidatos PETasa en un amplio rango de temperaturas de 30 a 60 °C utilizando varias muestras de PET, como polvo de PET transparente posconsumo (PC-PETTransparent), polvo de PET semicristalino (Cry- PET, Goodfellow Cambridge Ltd) (Cat. No. ES306000), y película de PET amorfo (AF-PET, Goodfellow Cambridge Ltd) (Cat. No. ES301445). Entre estos candidatos, PC3, PC7, PC8 y PC10 mostraron niveles relativamente bajos o indetectables de actividad hidrolítica de PET en las condiciones probadas (Fig. 1c y Fig. 3 complementaria). PC6, que tiene el valor de Tm más alto de 70,5 °C, produjo solo cantidades insignificantes de productos de hidrólisis de PET a 30 °C, pero mostró la actividad hidrolítica óptima de PET a 50 °C (Fig. 1b, cy Figs. 2, 3 complementarias). ). PC4 y PC5 mostraron una actividad hidrolítica de PET relativamente alta a 50 °C y 40 °C, respectivamente (Fig. 1c y Fig. complementaria 3). Sorprendentemente, en comparación con otros candidatos a PETasa, PC2 exhibió una actividad hidrolítica de PET significativamente alta en una amplia gama de condiciones de reacción. En particular, PC2 exhibió una actividad superior a 30 °C y produjo la mayor cantidad de productos de hidrólisis de PET en las tres condiciones de sustratos de PET en comparación con otros candidatos. (Fig. 1c y Fig. complementaria 3). Además, los resultados del perfil de pH para los ocho candidatos a PETasa también mostraron que PC2 mostró el nivel más alto de actividad hidrolítica de PET (Figura complementaria 4). Es de destacar que PC2 mostró una notable actividad hidrolítica de PET en comparación con las otras enzimas, y también exhibió una alta termoestabilidad con un valor de Tm de 66,8 °C (Fig. 1b, cy Fig. 2 complementaria). Además, PC2 tuvo el nivel de expresión soluble más alto en comparación con las otras enzimas (Fig. 1b). Estos resultados indican que la PC2 tiene excelentes propiedades para la degradación eficiente del PET, incluida la actividad enzimática, la termoestabilidad y los niveles de expresión de proteínas. Por lo tanto, seleccionamos PC2 (código de acceso: SHM40309.1, PETasa de Cryptosporangium aurantiacum, CaPETase) como la PET hidrolasa más robusta entre los ocho candidatos a PETasa probados. Las mediciones de los cambios del valor de Tm y la actividad mediante la adición de iones metálicos mostraron que PC2 no es una enzima dependiente de iones metálicos (Figura complementaria 5).

a Árbol filogenético de máxima probabilidad y matriz de identidad porcentual de los 10 candidatos de PETasa seleccionados (PC1-PC10) y 17 secuencias de PET hidrolasa informadas. Los valores de Bootstrap para 1000 replicaciones se muestran en los bordes de bifurcación. La barra de color representa el nivel de porcentaje de identidad de las enzimas, y los valores de porcentaje de identidad detallados se enumeran en la Figura complementaria 31. b Rendimiento de proteína y los valores de Tm de las 8 PC. c Actividad hidrolítica de PET de las ocho PC. La reacción se realizó con polvo de PET transparente posconsumo (PC-PETTransparent, 15 mg mL-1 con enzima 500 nM), polvo de PET semicristalino (Cry-PET, 15 mg mL-1 con enzima 2 µM) y material amorfo. Película de PET (AF-PET, 15 mg mL-1 con enzima 2 mM) en tampón glicina-NaOH pH 9,0 50 mM a varias temperaturas (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C) durante 3 días. Las reacciones se realizaron por triplicado; Los datos se presentan como valores medios ± DE. d Comparación de la actividad hidrolítica PET de CaPETase, IsPETase, LCC y TfCut2. La reacción se realizó con Cry-PET (15 mg mL-1 con enzima 2 µM) en glicina-NaOH 50 mM (pH 9,0) a varias temperaturas (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C) durante 12 h. Las reacciones se realizaron por triplicado; Los datos se presentan como valores medios ± DE.

A continuación, comparamos la actividad hidrolítica de PET de CaPETase con la de PET hidrolasas conocidas, como IsPETase, TfCut2 y LCC, en un amplio rango de temperaturas de 30 a 60 °C utilizando Cry-PET como sustrato. En reacciones a 30 °C, CaPETase mostró una actividad hidrolítica de PET significativamente mayor que LCC y TfCut2 (Fig. 1d y Fig. 3 complementaria). Además, CaPETase exhibió una actividad 1,4 veces mayor que IsPETase, que se sabe que tiene la mayor actividad hidrolítica de PET a temperatura ambiente entre las PET hidrolasas reportadas (Fig. 1d)17. En particular, la actividad hidrolítica PET de CaPETase fue 3,1 veces mayor que la de IsPETase a 40 ° C (Fig. 1d), probablemente porque CaPETase tiene una termoestabilidad mucho mayor que IsPETase. Sin embargo, la actividad hidrolítica del PET de CaPETasa a 60 °C disminuyó drásticamente y se revirtió en comparación con la del LCC a temperaturas de 50 °C y 60 °C (Fig. 1d). Estos resultados indican que CaPETasa es una PET hidrolasa prometedora que exhibe una alta capacidad de descomposición y termoestabilidad del PET. Considerando que es importante realizar mejoras sin la pérdida de actividad enzimática y termoestabilidad en el desarrollo de enzimas superiores que degradan PET37, proponemos que CaPETasa representa una enzima plantilla más eficiente para la ingeniería enzimática que otras enzimas con propiedades mesófilas y termófilas extremas, como como IsPETase y LCC, respectivamente.

Para proporcionar una base estructural para la alta actividad hidrolítica de PET de CaPETasa, determinamos su estructura cristalina con una resolución de 1,36 Å (Tabla complementaria 2). CaPETasa muestra un pliegue de hidrolasa α/β y una lámina β de nueve hebras en el centro rodeada por seis hélices α y dos hélices 310 (Fig. 2a y Fig. 6 complementaria). La superposición por pares independiente de la secuencia de CaPETase con tres hidrolasas de PET distintivas, a saber, IsPETase, LCC y TfCut2, generó valores de desviación cuadrática media global de 0,69, 0,65 y 0,53 Å, respectivamente. La formación de un enlace disulfuro conservado (DS, C279/C297) y la falta de un bucle extendido en el sitio de unión al sustrato de CaPETase sugieren que la enzima se originó a partir de un antepasado de TfCut2 y LCC en lugar de IsPETase (Figura complementaria 7). Curiosamente, CaPETase exhibe una estructura principal algo diferente en el sitio activo en comparación con otras PET hidrolasas (Figura complementaria 8). Debido a que se sabe que la comparación estructural utilizando un sistema de coordenadas cartesianas es subjetiva para distinguir las diferencias estructurales detalladas de las cadenas principales38, analizamos más a fondo los ángulos de torsión φ-ψ de las cadenas principales de estas cuatro PETasas (Figura complementaria 9) y encontramos que había diferencias locales en los ángulos de torsión de la columna vertebral entre CaPETasa y otras hidrolasas de PET (Fig. 2a y Fig. 10 complementaria). Curiosamente, CaPETase también mostró diferencias significativas en los ángulos de torsión de la columna vertebral en los cinco bucles de conexión (β3–α1, β4–α2, β6–β7, β7–α4 y β8–α5) que forman un sitio activo, mientras que las comparaciones de los correspondientes Los bucles entre las otras tres PET hidrolasas mostraron menos diferencias (Fig. 2a y Fig. 11 complementaria), lo que sugiere que CaPETase tiene una conformación de sitio activo única. Hubo algunas diferencias en la red de residuos que se extiende desde el sitio activo hasta el entorno espacial cercano en comparación con la de las otras PET hidrolasas. Entre ellos, observamos diferencias únicas que afectan los ángulos de torsión de la columna vertebral de estos bucles. Cerca del bucle β3-α1, distintos residuos ubicados en el bucle β4-α2 y una fuerza de red W105-L108-G124, que forman una red interna de cadena lateral única, parecen influir en la conformación del bucle β3-α1 (Figura complementaria .12). De hecho, el bucle β3-α1 tiene altos valores de fluctuación cuadrática media cerca de los sitios activos de otras PET hidrolasas en simulaciones de dinámica molecular39,40. Se forma una red única A192 – G212 – F248 debajo del bucle β8 – α5, donde se encuentra el H246 catalítico (Figura complementaria 13). En la posición F248 correspondiente en CaPETase, LCC y TfCut2 tienen un residuo de alanina, mientras que IsPETase tiene un residuo de cisteína que forma un segundo enlace disulfuro. Por lo tanto, la colocación de un F248 voluminoso podría causar diferencias torsionales significativas en el bucle β8-α5 y el bucle β7-α4 de CaPETase (Figura complementaria 13). Finalmente, una red R176-W200-F209 parece desencadenar diferencias conformacionales en la hélice α3 y el bucle β6-β7 (Figura complementaria 14). Es importante destacar que la hélice α3 contiene el catalizador S169, y el bucle β6-β7 se anotó previamente como un bucle oscilante que contiene triptófano en PETasa de Rhizobacter gummiphilus (Figura complementaria 14)41. Analizamos más a fondo las fluctuaciones de la columna vertebral de estas cuatro PET hidrolasas utilizando simulaciones de dinámica molecular y CaPETase exhibe un perfil de fluctuación de la columna vertebral bastante único (Fig. 2b y Fig. 15 complementaria). CaPETase tiene bucles β6 – β7 y β7 – α4 más estables que la IsPETase mesófila y, en particular, la enzima muestra una alta estabilidad en la región frontal del bucle catalítico β8 – α5 donde se encuentra H246 (Fig. 2b). Sin embargo, la región final de β8 – α5 que corresponde al bucle extendido de IsPETase, y la región frontal del bucle β3 – α1 mostraron la flexibilidad más alta y más baja entre los cuatro homólogos, respectivamente (Fig. 2b). Para nuestro interés, las diferencias en el perfil de fluctuación de la columna vertebral se localizaron exactamente en la red interna única que afecta los ángulos de torsión de la columna vertebral de estos bucles. Por lo tanto, creemos que la conformación única de la columna vertebral de CaPETasa permite que la enzima mantenga una alta actividad mientras estabiliza varios bucles flexibles de la PET hidrolasa mesófila.

a Comparación de las diferencias en el ángulo de torsión de la columna vertebral entre CaPETase e IsPETase, LCC y TfCut2. La estructura de cinco bucles de conexión que forman el sitio activo de CaPETase se muestra como una representación de tubo de masilla del mismo diámetro en PyMoL. La estructura está coloreada según los valores de distancia euclidiana entre los dos puntos de Ramachandran de los residuos alineados. Los colores del blanco al rojo designan valores de distancia euclidiana bajos a altos, respectivamente. La tríada catalítica de CaPETase se muestra como un modelo de barra con un círculo de color cian. b Las simulaciones MD muestran un perfil de fluctuación de la columna vertebral único de CaPETasa. Fluctuaciones cuadráticas medias del átomo de Cα (RMSF, Å) de CaPETase, IsPETase, TfCut2, LCC durante simulaciones de MD. c Comparación de los residuos que forman la hendidura de unión al sustrato de CaPETasa, LCC y TfCut2. Los residuos resaltados se muestran como un modelo de barra. d Residuos distintos en el sitio de unión al sustrato de CaPETasa. Los residuos distintos y conservados se presentan en magenta y azul claro, respectivamente. e Actividad hidrolítica del PET de las variantes. Se incubaron PC-PETTransparent (15 mg mL-1) con enzimas 500 nM a 40 °C durante 24 h en tampón glicina-NaOH 50 mM, pH 9,0. La cantidad total de productos lanzados y el valor Tm de las variantes se muestran como barras y puntos de color rojo, respectivamente. Las reacciones se realizaron por triplicado; Los datos se presentan como valores medios ± DE.

Además de la conformación única de la columna vertebral en el sitio activo, los residuos que forman la hendidura de unión al sustrato de CaPETasa mostraron diferencias significativas en comparación con otras PET hidrolasas termófilas (Fig. 2c, d). En las proximidades del oscilante W194, CaPETase posee residuos G196 y L133 únicos, donde se encuentran residuos altamente conservados en otras hidrolasas de PET (Fig. 2c, d y Fig. complementaria 7). La mutación de estos residuos a los residuos correspondientes en otras PET hidrolasas, como G196L, L133Y y L133Q, tuvo un efecto negativo sobre la actividad enzimática y/o la termoestabilidad (Fig. 2e). Sin embargo, la mutación G196T exhibió una termoestabilidad mejorada (Fig. 2e), que puede resultar de la formación de un enlace de hidrógeno entre G196T y N195. CaPETase también contiene un residuo I102 único en el bucle β3-α1 que muestra las mayores diferencias de torsión, mientras que otras PET hidrolasas contienen un residuo de treonina altamente conservado en la posición correspondiente, lo que probablemente permite que CaPETase forme una hendidura de unión al sustrato relativamente más amplia (Fig. 2c). , d y figura complementaria 16). El reemplazo de I102 con treonina resultó en una disminución de la actividad enzimática, lo que confirma que el residuo contribuye a una alta actividad enzimática (Fig. 2e). Además, CaPETasa tiene residuos únicos, como Q107, W168 y T250, en las regiones del bucle β3-α1, bucle β8-α5 y α3, mientras que la mayoría de los residuos correspondientes están altamente conservados en otras PET hidrolasas termófilas (Fig. .2c, d y Fig. complementaria 7). La mutación de estos residuos a residuos conservados en otras PET hidrolasas termófilas disminuyó la actividad enzimática y/o la estabilidad, lo que indica que el posicionamiento combinado de estos residuos es necesario para crear un sitio de unión de sustrato óptimo para CaPETasa con una forma y polaridad únicas (Fig. 2e). . Una excepción fue la mutación Q107S, que no produjo diferencias notables en la actividad enzimática o la termoestabilidad (Fig. 2e). En conjunto, sugerimos que, junto con los ángulos de torsión únicos de la columna vertebral, la colocación de distintos residuos en el sitio de unión del sustrato permite a CaPETase formar un sitio de unión de sustrato óptimo para una alta actividad hidrolítica de PET.

Aunque CaPETase tiene una alta actividad hidrolítica y termoestabilidad del PET, su rendimiento aún es insuficiente para aplicaciones industriales. Realizamos ingeniería de proteínas racional de CaPETase para mejorar aún más la actividad hidrolítica del PET y la termoestabilidad de la enzima utilizando varias estrategias, como la introducción de enlaces disulfuro y enlaces de hidrógeno y la modificación de la carga superficial de la proteína (Figura complementaria 17). La termoestabilidad de las variantes se controló midiendo los valores de Tm y la actividad hidrolítica del PET de las variantes se midió utilizando polvo de PET transparente posconsumo (PC-PETTransparent) a temperatura ambiente (40 °C). Introdujimos cuatro enlaces disulfuro, a saber, G76C/A143C (DS1), L180C/A202C (DS2), T204C/R233C (DS3) y R242C/S291C (DS4). Las mutaciones DS2 y DS4 aumentaron el valor de Tm en aproximadamente 3 °C, mientras que las mutaciones DS1 y DS3 disminuyeron el valor de Tm en comparación con CaPETaseWT (Fig. 3a y Fig. 18 complementaria). Además, la introducción de las mutaciones DS2 y DS4 aumentó la actividad hidrolítica del PET en más del 20% en comparación con CaPETaseWT (Fig. 3a y Fig. 18 complementaria). Estos resultados indican que las mutaciones DS2 y DS4 se formaron con éxito en CaPETaseWT y ejercieron efectos positivos sobre la actividad enzimática y la termoestabilidad. También intentamos mejorar la termoestabilidad de CaPETasa mediante la introducción de enlaces no covalentes, como enlaces de hidrógeno y puentes salinos, y diseñamos siete mutaciones, a saber, V129T (NC1), P136S (NC2), A192T (NC3), R198K (NC4), V203T. (NC5), A252N (NC6) y A257S (NC7). De estas, las mutaciones NC1 y NC4 aumentaron los valores de Tm en aproximadamente 2 °C y mejoraron la actividad hidrolítica del PET en un 30% en comparación con CaPETaseWT (Fig. 3a y Fig. 18 complementaria). Finalmente, en un intento por mejorar la capacidad de adsorción de proteínas en la superficie del PET modificando la carga de la superficie de la proteína, diseñamos cinco mutaciones para hacer que la superficie de la proteína sea hidrófoba, es decir, N109A (HP1), R151A (HP2), R157A (HP3), R160A (HP4) y R233A (HP5), y cuatro mutaciones para hacer que la superficie de la proteína sea positiva, es decir, T86R (SC1), A155R (SC2), T275R (SC3) y M294R (SC4). Desafortunadamente, la mayoría de las mutaciones no mostraron cambios significativos o incluso efectos negativos sobre la termoestabilidad o la actividad enzimática; sin embargo, la mutación HP1 aumentó el valor de Tm en 3,2 °C y la mutación SC2 mejoró la actividad hidrolítica de PET en un 20% en comparación con CaPETaseWT (Fig. 3a y Fig. 18 complementaria). En conjunto, introdujimos ocho mutaciones puntuales que dieron como resultado una termoestabilidad mejorada y una actividad hidrolítica del PET, es decir, DS2, DS4, NC1, NC4, HP1 y SC2, entre las 20 mutaciones diseñadas racionalmente probadas (Fig. 3a y Fig. 18 complementaria). ). También hubo mutaciones ambiguas que solo mejoraron la actividad enzimática o la termoestabilidad, como NC2, HP2 y HP5. Excluimos estas mutaciones de la selección final para desarrollar una variante mucho superior sin comprometer la actividad enzimática o la termoestabilidad (Fig. 3a y Fig. Suplementaria 18) 37.

a Mutaciones de un solo punto de CaPETasa. Se presentan los productos de hidrólisis del PET liberado y los valores de Tm de las mutaciones de un solo punto. Las reacciones se realizaron utilizando enzimas 500 nM con polvo de PET transparente posconsumo (PC-PETTransparent, 15 mg mL-1) como sustrato en tampón glicina-NaOH 50 mM (pH 9,0) durante 24 h a 40 °C. La reacción se llevó a cabo por triplicado; Las barras de error representan la SD de la medición replicada. b Mutaciones combinatorias de CaPETasa. Actividad hidrolítica del PET de las variantes generadas mediante la estrategia combinatoria. Se presentan los productos de hidrólisis del PET liberados por hora y los valores de Tm de las variantes combinatorias. Las reacciones se realizaron utilizando enzimas 500 nM con PC-PET (15 mg mL-1) como sustrato en tampón glicina-NaOH 100 mM (pH 9,0) a 40 °C durante 24 h y 60 °C durante 6 h, respectivamente. La reacción se llevó a cabo por triplicado; Las barras de error representan la SD de la medición replicada. c Comparación de la actividad de hidrólisis de PET entre CaPETaseM9 y LCCICCG a varias temperaturas. Las reacciones se llevaron a cabo a diferentes temperaturas utilizando PC-PETTransparent (12,5 mg mL-1) con enzima 1 µM y Cry-PET (12,5 mg mL-1) con enzima 4 µM bajo el tampón Glicina-NaOH 200 mM, pH 9,0. Las reacciones se realizaron por triplicado; Los datos se presentan como valores medios ± DE.

Integramos secuencialmente las seis mutaciones descritas anteriormente para desarrollar una variante de CaPETasa superior con mayor termoestabilidad y actividad hidrolítica de PET. Primero, combinamos las mutaciones DS2 y DS4, y la variante CaPETaseDS2/DS4 resultante mostró un efecto sinérgico sobre la termoestabilidad con un valor de Tm de 74,3 °C (ΔTm = 7,4 °C) (Fig. 3b y Fig. complementaria 19). Además, la variante mejoró la actividad hidrolítica del PET 1,35 y 4,45 veces a 40 °C y 60 °C, respectivamente, en comparación con CaPETaseWT (Fig. 3b y Fig. 19 complementaria). A continuación, configuramos CaPETaseDS2/DS4 como andamio para la siguiente combinación. Integramos las mutaciones NC1/NC4, HP1 y SC2 individualmente en CaPETaseDS2/DS4 utilizando nuestra estrategia de ingeniería. La adición de la mutación NC1/NC4 aumentó significativamente el valor de Tm en 3,9 °C y aumentó la actividad hidrolítica del PET tanto a 40 °C como a 60 °C (Fig. 3b y Fig. 19 complementaria). Mostró una actividad mejorada 3,8 y 17 veces a 60 °C en comparación con CaPETaseDS2/DS4 y CaPETaseWT, respectivamente (Fig. 3b y Fig. 19 complementaria). La adición de la mutación HP1 aumentó el valor de Tm en 2,7 °C y mejoró la actividad hidrolítica del PET 1,7 veces a 60 °C en comparación con CaPETaseDS2/DS4 (Fig. 3b y Fig. 19 complementaria). Cuando la mutación SC2 se integró en la variante CaPETaseDS2/DS4, no observamos mejoras notables en la actividad y la termoestabilidad; sin embargo, hubo un ligero aumento en la actividad hidrolítica del PET a 60 °C (Fig. 3b y Fig. 19 complementaria).

Estos resultados sugieren que las cuatro mutaciones (NC1, NC4, HP1 y SC2) tuvieron un efecto positivo sobre la termoestabilidad y la actividad de CaPETaseDS2/DS4; por lo tanto, combinamos las cuatro mutaciones en CaPETaseDS2/DS4 para generar CaPETaseDS2/DS4/NC1/NC4/HP1/SC2 (CaPETaseM8). Sorprendentemente, cuando se agregaron las cuatro mutaciones a CaPETaseDS2/DS4, se observó un efecto sinérgico sobre la termoestabilidad y la actividad enzimática, y CaPETaseM8 exhibió una termoestabilidad significativamente mejorada con un valor de Tm de 80,7 °C y una actividad hidrolítica de PET mejorada entre 1,5 y 25,8 veces a 40 °C y 60 °C, respectivamente, en comparación con CaPETaseWT (Fig. 3b y Fig. 19 complementaria).

Como se mencionó anteriormente, la mutación G196T produjo efectos positivos tanto en la termoestabilidad como en la actividad enzimática (Fig. 2e); por lo tanto, finalmente generamos CaPETaseDS2/DS4/NC1/NC4/HP1/SC2/G196T (CaPETaseM9) integrando la mutación G196T en CaPETaseM8. CaPETaseM9 exhibió un valor de Tm de 83,2 °C, lo que corresponde a un aumento de 16,7 °C en Tm en comparación con CaPETaseWT. Además, la actividad hidrolítica del PET de CaPETaseM9 aumentó 1,7 y 31,2 veces a 40 °C y 60 °C, respectivamente, en comparación con CaPETaseWT (Fig. 3b y Fig. complementaria 19). Estos resultados indican un efecto positivo de G196T en CaPETaseWT que se aplicó de manera similar a CaPETaseM8.

CaPETaseM9 mostró una actividad mucho mayor en todas las condiciones de temperatura de 30 a 70 °C y, en particular, mostró una actividad específica 41,7 veces mayor a 60 °C que CaPETaseWT (Figura complementaria 20). El resultado también se reprodujo en un sistema ampliado de matraces agitadores de 50 ml (Figura complementaria 21). Estos resultados demostraron la actividad enzimática mejorada y la termoestabilidad reforzada de CaPETaseM9. La termoestabilidad mejorada de la variante se verificó aún más mediante experimentos de inactivación por calor, donde CaPETaseM9 mantuvo su actividad incluso después de la incubación a 60 °C durante 12 h, mientras que CaPETaseWT mostró una pérdida completa de actividad en una hora (Figura complementaria 22).

Luego comparamos la actividad hidrolítica de PET de CaPETaseM9 con LCCICCG con PC-PET y Cry-PET a temperaturas que oscilan entre 30 y 60 °C. CaPETaseM9 mostró una actividad hidrolítica de PET significativamente mayor en comparación con LCCICCG, a 30 °C y 40 °C (Fig. 3c). A 50 °C y 60 °C, CaPETaseM9 mostró una actividad bastante similar en comparación con LCCICCG (Fig. 3c).

Para proporcionar información estructural sobre la capacidad mejorada de degradación de PET de CaPETaseM9, determinamos su estructura cristalina con una resolución de 1,53 Å (Fig. 4 y Tabla complementaria 2). La formación de los enlaces disulfuro DS2 y DS4 introducidos se observó claramente en CaPETaseM9, y la longitud interatómica S-S de ambos enlaces disulfuro estaba dentro del rango óptimo de longitud de enlaces disulfuro (Fig. 4 y Fig. complementaria 23). Curiosamente, DS4 estaba ubicado en las proximidades de uno de los sitios de unión de calcio de Cut190 y el punto de mutación de IsPETase R280A42,43, y la formación de DS4 también causó cambios significativos en el potencial electrostático de la superficie y la conformación de la región vecina (Fig. 4 y Figuras complementarias 23 y 24). La cadena lateral del V129T mutado se invirtió para formar un enlace de hidrógeno con los residuos T131 y D132 adyacentes, estabilizando así aún más el bucle de conexión β4-α3 (Fig. 4 y Figs. Suplementarias 23 y 25). Con respecto a R198K, el residuo de lisina mutado se movió hacia adentro para formar enlaces de hidrógeno con las cadenas principales de N195 y D222, estabilizando así el bucle tambaleante que contiene triptófano (Fig. 4 y Fig. 23 complementaria). El G196T mutado formó un enlace de hidrógeno mediado por agua con el residuo N195 adyacente, lo que resultó en una mayor estabilización del bucle tambaleante que contiene triptófano (Fig. 4 y Fig. complementaria 23). La mutación A155R cambió la superficie hidrofóbica a una carga positiva, lo que parece aumentar la unión de la enzima a la superficie del PET, como lo sugiere un informe anterior (Fig. 4 y Fig. complementaria 23)44. Finalmente, la mutación N109A pareció fortalecer las interacciones hidrofóbicas internas (Fig. 4 y Figs. complementarias 23 y 26).

La estructura cristalina de CaPETaseM9 se muestra como un diagrama de dibujos animados y los residuos mutados se muestran como una barra o un modelo de potencial electrostático de superficie.

Para evaluar la aplicabilidad industrial de CaPETaseM9, realizamos un experimento de descomposición de PET en un biorreactor con estado de pH utilizando PC-PETTransparent como sustrato (Figura complementaria 27). El biorreactor se hizo funcionar a 55 °C usando 2,70 mg de enzima ∙ gPET-1, y el pH se tituló continuamente a 8,0 añadiendo NaOH. La tasa de descomposición se midió monitoreando las cantidades liberadas de MHET y TPA. Después de una breve fase de retraso de una hora, que fue necesaria para la hidrofilización inicial, la tasa de degradación del PET aumentó exponencialmente y el 50% de PC-PETTransparent se despolimerizó en 4 h (Fig. 5a). En la segunda mitad de la reacción, la velocidad de degradación disminuyó ligeramente debido a una disminución en la cantidad de sustrato; sin embargo, se logró una tasa de degradación final del 94,1% después de 12 h (Fig. 5a). Este fue un resultado significativo en términos de demostrar que se podría lograr una alta tasa de despolimerización del 90 % o más incluso a 55 °C, que es una condición de temperatura relativamente más baja que la temperatura Tg. Este resultado también indicó que CaPETaseM9 tiene una actividad hidrolítica de PET significativa y una termoestabilidad comparable a otros biocatalizadores de referencia. También realizamos la descomposición de un polvo de PET coloreado posconsumo (PC-PETColored), que se sabe que es relativamente difícil de reciclar debido a la presencia de colores, aditivos, estructura multicapa, etiquetas y otras complejidades45. Curiosamente, la tasa de despolimerización de PC-PETColored fue casi idéntica a la de PC-PETTransparent, mostrando una despolimerización del 50% en 4 h (Fig. 5b); sin embargo, la tasa de despolimerización final de PC-PETColored fue del 89,2% a las 12 h, que fue ligeramente menor que la de PC-PETTransparent (Fig. 5b). Probablemente esto se deba a las impurezas presentes en PC-PETColored. Estos resultados demuestran que, a diferencia de otros métodos de reciclaje, el bioreciclaje de plástico PET se puede lograr independientemente del color del plástico PET.

Descomposición de polvo de PET transparente post-consumo (PC-PETTransparent) (a) y polvo de PET coloreado post-consumo (PC-PETColored) (b) en un biorreactor de pH-stat usando CaPETaseM9. Las reacciones se realizaron por triplicado de forma independiente; Los datos se presentan como valores medios ± DE. c Degradación completa de un envase de PET posconsumo utilizando CaPETaseM9 a 60 °C. Las reacciones se realizaron por triplicado; Los datos se presentan como valores medios ± DE.

Finalmente, determinamos si CaPETaseM9 puede despolimerizar los contenedores de PET posconsumo no tratados. A medida que avanzaba la despolimerización, la película de PET se volvió opaca y delgada, y desapareció por completo en 3 días (Fig. 5c). Estos resultados sugieren que CaPETaseM9 se puede utilizar para descomponer plásticos PET con diversas propiedades físicas.

A medida que los desechos plásticos se convierten en un problema ambiental, la investigación sobre la despolimerización enzimática de PET para desechos plásticos se está expandiendo como una alternativa sostenible para el tratamiento y reciclaje de desechos plásticos. Por lo tanto, se han llevado a cabo activamente investigaciones centradas en el descubrimiento de enzimas prometedoras que degradan el PET y, hasta la fecha, se han identificado y caracterizado bioquímicamente más de 20 enzimas que degradan el PET46,47. Además, se han realizado estudios sobre el desarrollo de enzimas robustas que degradan el PET mediante diversas estrategias de ingeniería, como el diseño racional, la evolución dirigida y enfoques guiados por computación. Aunque los informes sobre el desarrollo de variantes eficientes de enzimas que degradan el PET están aumentando rápidamente, las enzimas objetivo para el desarrollo de variantes superiores se centran en unas pocas PET hidrolasas, como IsPETasa y LCC, que tienen excelentes propiedades catalíticas y de termoestabilidad, respectivamente. En este trabajo, informamos sobre una enzima que degrada el PET, CaPETasa, con propiedades de PET hidrolasa tanto mesófilas como termófilas; Muestra mayor actividad que IsPETase en condiciones ambientales y tiene un valor de Tm de 66,8 °C. Se propuso un posicionamiento de serina para la oscilación del triptófano y un bucle extendido para el acceso enzima-sustrato como características estructurales clave de IsPETase por su alta actividad a temperatura ambiente21,22,48. Aunque CaPETasa muestra una alta actividad a temperatura ambiente, la enzima no comparte estas características estructurales de la PET hidrolasa mesófila (Figura complementaria 7). Además, su perfil de fluctuación de la columna vertebral mostró que la flexibilidad general en el sitio activo es menor que la de IsPETase (Fig. 2b), lo que sugiere que tiene una alta actividad en condiciones ambientales a través de una característica estructural diferente a la de IsPETase. El análisis estructural de CaPETase con tres enzimas representativas que degradan PET, como IsPETase, TfCut2 y LCC, mostró que CaPETase tiene torsiones de columna vertebral únicas de los bucles del sitio activo causadas por tres diferencias principales de redes internas. Una de las distintas redes internas se encuentra debajo del bucle β8-α5 (Figura complementaria 13). Es digno de mención señalar que el enlace disulfuro único de IsPETase corresponde a esta región y que los reemplazos de los dos residuos de cisteína con alanina disminuyen severamente su actividad hidrolítica de BHET y PET22. En comparación con LCC y TfCut2 que tienen una red AAT, CaPETase tiene una red G212-F248-A192 única que tiene la voluminosa cadena lateral hidrofóbica "anclada" a la región central (Figura complementaria 13). Presumiblemente, el anclaje de fenilalanina en la red permitió a CaPETase mantener una menor perturbación de la posición catalítica de H246 en la región frontal del bucle β8-α5, aunque la enzima muestra una fluctuación de la columna vertebral relativamente mayor en la región media del bucle β8-α5 (Fig. .2b,c). La región media del bucle β8-α5 en CaPETase contiene un residuo T250 único, que interactúa con W168 y el bucle β3-α1 (Fig. 2b, c). La formación de este entorno único se extiende a la red única W105-L108-G124 en la interfaz entre los bucles β3 – α1 y β4 – α2 (Figura complementaria 12). La red R176-W200-F209 del bucle β6-β7 también es digna de mención, ya que se ha informado que esta región es importante para la actividad de las enzimas mesófilas41,42,48. En conjunto, las características estructurales únicas y el perfil dinámico de la columna vertebral de CaPETase parecen contribuir a su estabilidad y alta actividad al mismo tiempo.

A través del diseño racional de CaPETase, se realizó ingeniería combinatoria de andamiaje para aumentar la estabilidad térmica y la eficiencia catalítica de la enzima y, como resultado, se llevó a cabo una mejora considerable en el valor de Tm (ΔTm = 16,7 °C) y la eficacia catalítica (aumentada en 41,7 °C). -pliegues). Como parte de esfuerzos adicionales para evaluar la capacidad de CaPETaseM9, las comparaciones con la enzima de referencia y el funcionamiento del biorreactor con estado de pH aclararon que CaPETaseM9 tiene un rendimiento de descomposición de PET suficiente para aplicaciones industriales. Por lo tanto, a través de la ingeniería de proteínas racional guiada por la estructura de CaPETase, desarrollamos CaPETaseM9 con una actividad hidrolítica y termoestabilidad de PET dramáticamente mejoradas y demostramos que esta variante tiene suficiente capacidad de despolimerización de PET para aplicaciones industriales. Nuestra estrategia de ingeniería podría proporcionar información para mejorar la actividad catalítica y la termoestabilidad de otras enzimas junto con el diseño racional utilizado en este estudio. La aparición de una CaPETasa que tenga propiedades de PET hidrolasa mesófila y termófila ampliará el espectro de enzimas para la ingeniería enzimática y acelerará la implementación del reciclaje biológico de PET.

El polvo de PET transparente posconsumo (PC-PETTransparent) y el polvo de PET coloreado posconsumo (PC-PETColored) utilizados en este estudio se produjeron triturando hojuelas de PET compradas a una empresa de reciclaje (Yoochang R&C, República de Corea). Antes de la molienda para producir polvo de PET, las hojuelas de PET se lavaron con agua y se secaron a una temperatura de 160 °C durante 6 h. Las hojuelas de PET ampliamente secas se alimentaron a la extrusora de doble tornillo con temperaturas establecidas en 260 °C en las zonas de extrusión, 275 °C en las zonas de descarga a 275 °C y 275 °C en la placa de matriz, y una velocidad de extrusión de 50 rpm. Luego, el filamento se enfrió secuencialmente en dos baños de agua a temperaturas de 75 °C y 60 °C, y el exceso de agua se eliminó utilizando limpiadores de aire. Luego, se empleó una matriz de un solo orificio con un diámetro de 3,0 mm para la peletización, dando como resultado gránulos de aproximadamente 3 mm de longitud. Los gránulos de PET obtenidos se micronizaron utilizando un molino de microbolas criogénico. El análisis de la distribución del tamaño de partículas de las muestras de PET se realizó utilizando un analizador de tamaño de partículas HORIBA LA 960S2 de acuerdo con la norma ISO 13320. Las distribuciones de tamaño de partículas, cristalinidades y pesos moleculares (Mn, Mw, Mz) de PC-PETTransparent y PC-PETColored son presentado en las Figs complementarias. 28, 29 y cuadro complementario. 3.

Las secuencias se recuperaron de la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes (nr) del NCBI mediante PSI-BLAST (parámetros: valor E de 1,00E-58, % de identidad >40%) utilizando PETasa de I. sakaiensis (código de acceso: GAP38373.1) para consultar el modelo. Se eliminaron genes parciales de las secuencias recuperadas y luego se seleccionaron aleatoriamente las secuencias de los candidatos a PETasa del conjunto de datos. El alineamiento de secuencias múltiples se realizó utilizando Clustal omega49. La reconstrucción filogenética se realizó mediante máxima verosimilitud (ML) utilizando MEGA11 con Dayhoff w/freq. modelo50,51. Se muestra el árbol con la mayor probabilidad logarítmica (−10401,10). Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos Neighbor-Join y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas utilizando el modelo JTT, y luego se seleccionó la topología con un valor de probabilidad logarítmica superior. Se utilizó una distribución gamma discreta para modelar las diferencias de tasas evolutivas entre sitios (5 categorías [+G, parámetro = 1,6961]). El modelo de variación de tasa permitió que algunos sitios fueran evolutivamente invariables ([+I], 4,28% de sitios). Este análisis involucró 27 secuencias de aminoácidos y hubo un total de 444 posiciones en el conjunto de datos final. Los valores de Bootstrap se obtuvieron a partir de 1.000 réplicas52. La alineación de secuencias de las enzimas utilizadas en el análisis de árboles filogenéticos se representó como una ilustración gráfica utilizando ESPript3 (Figura complementaria 1)53. La identidad por pares y la similitud de las proteínas se calcularon utilizando el método Clustal omega y se creó una matriz de identidad de secuencia utilizando el software Excel.

Todas las proteínas utilizadas en este estudio tenían codones optimizados para la expresión de E. coli. Se eliminaron las secuencias de los péptidos señal y se agregaron sitios de restricción NdeI y XhoI a los extremos 5' y 3' de las secuencias del gen diana, respectivamente. Estas secuencias de ADN fueron sintetizadas por Twist Bioscience sin secuencias de péptidos señal. Los sitios de escisión del péptido señal para cada secuencia se predijeron utilizando el servidor SignalP 3.0. Se subclonaron diez genes candidatos de PETasa, así como TfCut2 y LCC, en un vector de expresión pET21b, y se subclonó IsPETasa en un vector de expresión pET15b. Los experimentos de mutagénesis dirigida al sitio se realizaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los oligonucleótidos enumerados en la Tabla complementaria 4. Todas las variantes se verificaron mediante secuenciación.

Los vectores construidos se transformaron en la cepa de E. coli Rosetta gami-B (DE3), que se cultivó en caldo de lisogenia que contenía 100 mg L-1 de ampicilina a 37 °C hasta que la densidad óptica del caldo de cultivo alcanzó un valor de 0,6 a 600 Nuevo Méjico. Después de la inducción mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido 0,5 mM, el cultivo se incubó adicionalmente a 18 °C durante 20 h. Las células se recogieron mediante centrifugación a 4000 xg durante 15 minutos a 20 °C. El sedimento celular de los 10 candidatos a PETasa, LCC y TfCut2 se resuspendió en tampón de lisis A (Tris-HCl 40 mM, pH 8,0), y el sedimento celular de IsPETasa se resuspendió en tampón de lisis B (Na2HPO4-HCl 50 mM, pH 7.0). La lisis celular se realizó mediante ultrasonidos y los lisados ​​​​celulares se centrifugaron a 13.500 x g durante 30 minutos. Las enzimas crudas libres de células se purificaron usando una columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen). Después de lavar con los tampones A y B que contenían imidazol 30 mM, las proteínas diana se eluyeron usando imidazol 300 mM en los tampones A y B. Todos los experimentos de purificación de proteínas se realizaron a 4 °C. Las proteínas purificadas se verificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio y se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro de microplacas BioTekTM Epoch y el software de análisis de datos de microplacas Gen5TM. Las enzimas purificadas se concentraron utilizando una unidad de filtro Amicon Ultra Centrifugal (valor de corte de peso molecular de 10.000, Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). La expresión y purificación de las variantes de CaPETase se realizaron en las mismas condiciones que el tipo salvaje.

La estabilidad térmica de las enzimas se determinó estableciendo curvas de fusión con un colorante de cambio térmico de proteínas (Applied Biosystems) utilizando un instrumento de PCR en tiempo real StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific). La mezcla de reacción contenía 5 µg de proteínas, Na2HPO4-HCl 100 mM (pH 7,0) y 20 µl de colorante de cambio térmico de proteína 1X. Los cambios de señal que representan la desnaturalización de las proteínas se controlaron aumentando la temperatura de 25 °C a 99 °C. Las temperaturas de fusión se estimaron a partir de la curva de la primera derivada. Las curvas de la primera derivada de RFU para CaPETaseWT y sus variantes se presentan en la figura complementaria 30.

La cristalización de CaPETaseWT y CaPETaseM9 se realizó inicialmente con pantallas de matriz de repuesto disponibles comercialmente Wizard I y II (Rigaku), PEG/Ion, Index (Hampton Research) y Wizard CRYO I y II (Rigaku) ​​utilizando el método de difusión de vapor en gota sentada. a 20°C. Para cada experimento, se mezcló 1,0 µL de la solución de proteína (CaPETaseWT: 18,4 mg mL-1 en Tris 40 mM, pH 8,0, y CaPETaseM9: 22,3 mg mL-1 en Tris 40 mM, pH 8,0) con 1,0 µL de solución de depósito. y la gota se equilibró con 50 µl de solución de depósito. El cristal de CaPETaseWT apareció en condiciones de 12% (v/v) de PEG 3350 y malonato de sodio 0,1 M (pH 4,0). El cristal de CaPETaseM9 se formó en condiciones de 10% (v/v) de monometiléter de polietilenglicol 5.000, HEPES 0,1 M, pH 7,0 y 5% de tacsimato, pH 7,0. Los cristales de mayor calidad de CaPETaseWT y CaPETaseM9 se transfirieron a una solución crioprotectora compuesta de las condiciones correspondientes descritas anteriormente con 25% (v/v) de glicerol. Los cristales se extrajeron con un asa y se congelaron instantáneamente con un chorro de nitrógeno líquido. Los datos se recopilaron utilizando una línea de luz de 7 A del Laboratorio del Acelerador de Pohang (República de Corea) bajo 100 K54. Todos los datos de difracción se indexaron, integraron y escalaron utilizando el software HKL200055. Los cristales CaPETaseWT pertenecían a un grupo espacial P21212 con un parámetro de celda unitaria: a = 82,31 Å, b = 82,45 Å, c = 87,39 Å y α = β = γ = 90°. Las dos moléculas de CaPETaseWT estaban en una unidad asimétrica y el volumen de cristal por unidad de proteína era de 2,68 Å3 Da-1, correspondiente a un contenido de disolvente del 52,25%56. La estructura de CaPETaseWT se determinó mediante reemplazo molecular con la versión CCP4 de MOLREP utilizando la estructura de la cutinasa 1 de Thermobifida cellulosilytica (código PDB: 5LUI) como modelo de búsqueda57,58. El modelo de estructura se construyó utilizando el programa WinCoot y el refinamiento de la estructura se realizó utilizando el programa CCP4 REFMAC559,60. El cristal de CaPETaseM9 pertenecía al grupo espacial P21212 con un parámetro de celda unitaria: a = 41,02 Å, b = 112,31 Å, c = 112,54 Å y α = β = γ = 90°. La unidad asimétrica contenía dos moléculas de CaPETasaM9, y el volumen de cristal por unidad de proteína fue de 2,3468 Å3 Da-1, correspondiente a un contenido de disolvente del 45,37%56. La estructura de CaPETaseM9 se determinó mediante reemplazo molecular con la versión CCP4 de MOLREP utilizando la estructura de CaPETaseWT como modelo de búsqueda57. La construcción y el refinamiento del modelo se realizaron como se describe anteriormente. Las estadísticas se resumen en la Tabla complementaria 2. Las estructuras de CaPETaseWT y CaPETaseM9 se depositaron en el Protein Data Bank, con los códigos PDB 7YM9 y 7YME, respectivamente.

Las estructuras depositadas de 5XJH (G30-S290), 4EB0 (S36-Q293), 4CG1 (A1-F261) y 7YM9 (D43-F299) se utilizaron para los residuos de IsPETase, LCC, TfCut2 y CaPETase y las coordenadas de agua de la cavidad interna. Todos los modelos de proteínas se prepararon con estados de protonación a pH 9, según lo calculado por propka361. Los sistemas se prepararon con parámetros ff19SB y OPC para proteína y agua explícita y se solvataron en una caja cúbica de 70 Å de longitud con iones Na+ y Cl- 0,1 M. Minimizamos los sistemas usando gromacs con algoritmo de gradiente conjugado y equilibrados con NVT durante 1 ns a 323,15 K, y luego equilibrados con NPT durante 1 ns con una restricción de fuerza de 1000 kJ∙mol−1∙nm−2. Las simulaciones de producción se realizaron durante 200 ns a 323,15 K y las fluctuaciones rms se calcularon con trayectorias de intervalo de 10 ps. Todas las simulaciones se realizaron utilizando el paquete Gromacs versión 2021.362.

En el ensayo preliminar de degradación de PET de ocho candidatos a PETasa, se empapó PC-PETTransparent (15 mg ml-1) en tampón glicina-NaOH 50 mM, pH 9,0, con enzima 500 nM. Se empaparon Cry-PET (15 mg ml-1) y una película de PET amorfa perforada (⌀6 mm, aproximadamente 10 mg) en tampón glicina-NaOH 50 mM, pH 9,0, con enzima 2 µM. Luego, las mezclas de reacción (1 ml) se incubaron a temperaturas de 30 °C, 40 °C, 50 °C y 60 °C durante 3 días. La reacción se terminó calentando la mezcla a 95 °C durante 10 min. La mezcla de reacción con polvo de PET se filtró usando un filtro de jeringa de PVDF (0,22 µm) para eliminar el sustrato residual. Luego, las muestras se analizaron mediante HPLC. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Los perfiles de pH en ocho candidatos a PETasa se realizaron utilizando PC-PETTransparent (15 mg mL-1) en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 6-7), tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7-9) y glicina 50 mM. -Tampón NaOH (pH 9-10) a 30 °C durante 3 días. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Para comparar la actividad hidrolítica de PET de CaPETase con LCC, IsPETase y TfCut2, se prepararon 15 mg de Cry-PET y se sumergieron en 1 ml de tampón de glicina-NaOH 50 mM, pH 9,0, con enzima 2 µM. La mezcla de reacción se incubó a 30 °C, 40 °C, 50 °C y 60 °C durante 12 h. Luego, la mezcla de reacción se trató como se describe anteriormente y se analizó usando HPLC. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

La actividad hidrolítica PET de CaPETaseWT y sus variantes se determinó utilizando PC-PETTransparent. Las reacciones enzimáticas se realizaron con enzimas 500 nM en 1 ml de tampón glicina-NaOH (pH 9,0) 50 mM a 40 °C durante 24 h. La mezcla de reacción se trató como se describió anteriormente y se analizó usando HPLC. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Para evaluar la actividad hidrolizante de PET de las variantes combinatorias de CaPETasa, se incubó enzima 500 nM con glicina-NaOH 100 mM (pH 9,0) y 15 mg de PC-PETTransparent a 40 °C durante 24 h y 60 °C durante 6 h. , respectivamente. La mezcla de reacción se trató como se describió anteriormente y las muestras diluidas dos veces se analizaron usando HPLC. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

La comparación de las actividades hidrolíticas de PET de CaPETaseWT y CaPETaseM9 se realizó utilizando PC-PETTransparent (15 mg mL-1) a 30, 40, 50, 60, 70 °C con enzimas 1 µM en 1 ml de glicina-NaOH 50 mM (pH 9.0) búfer. Para evaluar más a fondo CaPETaseM9 para la despolimerización de PET, se añadió la enzima (1 µM) a 50 ml de glicina-NaOH 200 mM, pH 9,0, que contenía 100 mg de PC-PETTransparent en un matraz de 250 ml. El matraz se incubó en una incubadora con agitación a 40 °C, 50 °C, 60 °C y 180 rpm (40 °C durante 72 h; 50 °C durante 48 h; y 60 °C durante 12 h). Se tomaron muestras de las mezclas de reacción en diferentes momentos para cuantificar la cantidad total de monómeros de PET liberados. Las muestras se filtraron como se describió anteriormente y las muestras diluidas 4 veces se analizaron usando HPLC. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

Para comparar la actividad hidrolítica de PET de CaPETaseM9 con LCCICCG, se utilizó un sistema de catálisis enzimática encerrado en membrana (MEEC). En este sistema, la reacción de degradación del PET se indujo en una membrana de diálisis de celulosa (Spectra/Por 2 Trial Kit, 12–14 kD, ancho plano 25 mm; Repligen, EE. UU.), y se utilizaron PC-PETTransparent y Cry-PET como sustrato. . Se sumergieron 50 (± 2) mg de sustrato PC-PETTransparent y Cry-PET en 4 ml de glicina-NaOH 200 mM, pH 9,0, con enzima 1 µM y 4 µM, respectivamente. Cada reacción se empaquetó en una bolsa de diálisis de 4 ml y se sumergió en 200 ml de glicina-NaOH 200 mM, pH 9,0. La reacción se realizó a 30 °C, 40 °C, 50 °C y 60 °C con agitación a 80 rpm en una pequeña incubadora con agitación (JEIO TECH, República de Corea). La muestra se tomó de la solución de equilibrio externo, se diluyó 5 veces y luego se analizó mediante HPLC. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

Los experimentos de inactivación térmica de proteínas se realizaron utilizando CaPETaseWT y CaPETaseM9. Las mezclas de enzimas (enzima 500 nM en 1 ml de glicina-NaOH 50 mM, pH 9,0) se incubaron a 60 °C y 70 °C durante 10 min a 12 h y 5 min a 12 h, respectivamente. Luego, se agregaron 15 mg de PC-PETTransparent a la mezcla inactivada por calor y la mezcla de reacción se incubó a 40 °C durante 1 día. La mezcla se filtró usando un filtro de jeringa de PVDF (0,22 µm) y las muestras se analizaron usando HPLC.

Se diseñó un biorreactor agitado personalizado (MARADO-PDA, BIOCNS Co. Ltd, Corea) equipado con dos impulsores Rushton estándar para la despolimerización de PET. Estaba interconectado con una computadora personal para el registro de datos. La temperatura se reguló mediante un circulador de baño de refrigeración y calefacción (RW3-1025, JEIO TECH, Daejeon, República de Corea). Se añadió CaPETaseM9 (10,2 mg) a una solución de 150 ml que contenía Na2HPO4 10 mM (pH 8,0) y 3,75 g de PC-PET y se incubó a 55 °C y 200 rpm. El pH se reguló a 8,0 añadiendo una solución de NaOH 0,3575 M (40 %; grado extra puro, Duksan, República de Corea) utilizando un controlador PID. Se tomaron muestras de la solución del reactor durante la reacción y se filtró a través de un filtro de jeringa de PVDF (0,22 µm) para eliminar el polvo de PET residual. Las muestras resultantes se diluyeron con glicina-NaOH 50 mM (pH 9,0) y se analizaron mediante HPLC para cuantificar la cantidad de monómero de PET liberado. La tasa de despolimerización del PET se calculó considerando la suma de los productos de hidrólisis (TPA y MHET). Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

Se prepararon fragmentos de un recipiente de PET posconsumo (recipiente para ensalada) en forma circular (⌀14 mm, 50 mg). La reacción se realizó utilizando un método de catálisis enzimática encerrada en una membrana. La bolsa de membrana de diálisis (Carl Roth, número de producto 0653.1, MWCO 14000) se cargó con 1 µM de CaPETaseM9 disuelta en 4 ml de tampón de glicina-NaOH (pH 9,0) 50 mM y fragmento de PET posconsumo. La bolsa de membrana llena se sumergió en un recipiente que contenía 196 ml de tampón glicina-NaOH (pH 9,0) 50 mM y se incubó en un agitador durante 84 h a 60 °C y 80 rpm. Se retiraron muestras de la solución en el exterior en diferentes puntos de tiempo (0, 12, 24, 30, 36, 48, 60, 72 y 84 h) para cuantificar la cantidad total de monómeros de PET liberados. Las muestras se analizaron mediante HPLC. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

Las muestras se analizaron utilizando un CBM-20A (Shimadzu, Kyoto, Japón) conectado a un detector UV/Vis (SPD-20A) y una columna C18 (Shimadzu Shim-pack GIS ODS-I C18, 5 µm, 4,6 × 150 mm). . Las fases móviles A (0,1% de ácido fórmico) y B (20% de acetonitrilo) se utilizaron a un caudal de 1 ml min-1. El programa de elución fue el siguiente: 0–2 min, 60%–80% de tampón B, gradiente lineal; 2 a 8 min, 80 % a 100 % de tampón B, gradiente lineal; 8 a 16 min, 100 % de tampón B. Los productos de hidrólisis (TPA, MHET y BHET) se separaron a 40 °C y se detectaron a 260 nm. Las cantidades de TPA, MHET y BHET se midieron utilizando curvas estándar preparadas a partir de TPA comercial (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU., n.º de catálogo: 185361), BHET (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU., n.º de catálogo: 465151). ) y MHET (Ambeed, IL, EE. UU., n.º de catálogo: A875019).

La cristalinidad térmica de las muestras de PET se estimó utilizando un instrumento de calorimetría diferencial de barrido (DSC) (Q2000, instrumento TA). Para los termógrafos DSC, se equilibraron 5 mg de muestras a 30 °C y se calentaron a 300 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C min-1. La muestra se enfrió a 30 °C a 10 °C min-1. El calor de fusión (ΔHm) y la cristalización en frío (ΔHc) se determinaron integrando las áreas (J g-1) debajo de los picos. La entalpía de fusión de un PET totalmente cristalino (∆Hf) fue de 140,1 J/g. El porcentaje de cristalinidad se calculó basándose en la siguiente ecuación:

Las curvas de DSC para la cristalinidad de las muestras de PET se presentan en la figura complementaria 29.

El peso molecular de las muestras de PET se midió mediante cromatografía de permeación en gel (GPC) utilizando un instrumento EcoSEC HLC-8320 GPC (Tosoh Bioscience, Tokio, Japón). La columna TSKgel SuperAWM-H se utilizó con una fase móvil de trifluoroacetato de sodio (NaTFA) 0,01 N en hexafluoroisopropanol (HFIP) a un caudal de 0,3 ml min-1 a 40 °C y un tiempo de ejecución de 30 min por muestra. El volumen de muestra inyectada fue de 20 μL. Los pesos moleculares (Mn, Mw, Mp) se determinaron en relación con estándares de polimetilmetacrilato (PMMA). Las muestras de PET y PMMA se disolvieron en hexafluoroisopropanol (HFIP) al 6% v/v en cloroformo hasta una concentración de 3 mg mL-1, y la solución se filtró a través de una membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) con un tamaño de poro de 0,45 μm.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los modelos refinados de CaPETaseWT, CaPETaseM9 generados en este estudio se han depositado en Protein Data Bank con los códigos PDB 7YM9 y 7YME. Hemos utilizado la siguiente estructura publicada, código PDB 5LUI, como modelo de búsqueda para el reemplazo molecular inicial. Los datos sin procesar de las cifras generadas en este estudio se proporcionan en el archivo de datos fuente. Los valores de porcentaje de identidad para las secuencias utilizadas en el análisis filogenético se proporcionaron en la Figura complementaria 31. Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Desarrollo de Tecnología Bio y Médica de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (NRF-2020M3A9I5037635) y el Programa de Investigación Cooperativa para el Desarrollo de Ciencia y Tecnología Agrícola (Proyecto No. PJ01492602) , Administración de Desarrollo Rural, República de Corea. Esta investigación también fue apoyada por el Programa de Innovación Tecnológica (20018132, Desarrollo de plásticos de polibutileno biodegradables, PBAT y PBS, a partir de biomasa) financiado por el Ministerio de Comercio, Industria y Energía (MOTIE, Corea).

Estos autores contribuyeron igualmente: Hwaseok Hong, Dongwoo Ki.

Facultad de Ciencias de la Vida, BK21 FOUR KNU Creative BioResearch Group, Instituto KNU de Microorganismos, Universidad Nacional Kyungpook, Daegu, 41566, República de Corea

Hwaseok Hong, Dongwoo Ki, Hogyun Seo, Jiyoung Park y Kyung-Jin Kim

Instituto de Biotecnología, CJ CheilJedang Co., Suwon-si, Gyeonggi-do, 16495, República de Corea

Jaewon Jang

Zyen Co, Daegu, 41566, República de Corea

Kyung Jin Kim

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K.-JK concibió el proyecto y supervisó la investigación. HH y DK realizaron el experimento cristalográfico y SH contribuyó al análisis computacional. HH y DK diseñaron las variantes de enzimas y realizaron los experimentos de degradación de PET. HH, DK y JP analizaron los datos. HH y K.-JK participaron en la redacción del manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y SH y JJ brindaron orientación para este manuscrito.

Correspondencia a Kyung-Jin Kim.

Los autores no declaran ningún interés en conflicto.

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Reimpresiones y permisos

Hong, H., Ki, D., Seo, H. et al. Descubrimiento e ingeniería racional de PET hidrolasa con propiedades de PET hidrolasa tanto mesófilas como termófilas. Nat Comuna 14, 4556 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40233-w

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Recibido: 04 de enero de 2023

Aceptado: 13 de julio de 2023

Publicado: 28 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40233-w

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